La secuenciación precisa del material genético es crucial en la biología moderna, particularmente para comprender y abordar enfermedades relacionadas con anomalías genéticas. Sin embargo, las metodologías actuales encuentran limitaciones sustanciales.

Ahora, un consorcio internacional de investigadores, dirigido por el prof, Adam Cribbs, especializado en biología computacional, y Jianfeng Sun, investigador asociado postdoctoral en el Instituto Botnar de la Universidad de Oxford, ha desarrollado un método innovador para corregir errores en la amplificación por PCR, una técnica ampliamente utilizada en la secuenciación de alto rendimiento.

"La amplificación por PCR, esencial para la mayoría de las técnicas de secuenciación de ARN, puede introducir errores y comprometer la integridad de los datos. Abordamos este problema sintetizando códigos de barras UMI utilizando bloques de nucleótidos homotrímeros, mejorando la corrección de errores y permitiendo una cuantificación casi absoluta de moléculas de ARN, mejorando notablemente la precisión del recuento molecular", expuso el investigador Jianfeng.

Al identificar los artefactos de la PCR como la fuente principal de cuantificación inexacta, la investigación, publicada en ´Nature Methods´, aborda un desafío en la generación de recuentos absolutos precisos de moléculas de ARN, lo cual es crucial para diversas aplicaciones en la investigación genómica.

Identificadores moleculares

Los autores de este trabajo se centraron en los identificadores moleculares únicos (UMI), que son secuencias aleatorias de oligonucleótidos que se utilizan para eliminar los sesgos introducidos durante la amplificación por PCR. Si bien los UMI se han adoptado ampliamente en los métodos de secuenciación, el estudio revela que los errores de la PCR pueden socavar la precisión de la cuantificación molecular, particularmente en diferentes plataformas de secuenciación.

"Al construir UMI a partir de bloques homogéneos de nucleósidos, nuestro objetivo era mejorar la corrección de errores en la secuenciación de lectura corta y larga, mostrando nuestro compromiso de mejorar las aplicaciones de la tecnología de secuenciación", afirmó el profesor asociado Adam Cribbs, autor principal del artículo y líder del grupo. en biología computacional.

Al respecto, el estudio demostró que los UMI homotrímeros superan significativamente a los UMI monómeros tradicionales en la reducción del enriquecimiento de falsos positivos durante el análisis de genes y transcripciones expresados ​​diferencialmente (DEG y DET). Esta mejora es vital para la identificación y cuantificación precisas de DEG o DET, particularmente en enfoques de secuenciación masiva. Además, en la secuenciación unicelular, donde a menudo se requiere una amplia amplificación por PCR, los UMI homotrímeros han demostrado ser eficaces para mitigar los efectos de los artefactos de la PCR, mejorando así sustancialmente la confiabilidad de los datos de secuenciación.

En definitiva, la corrección de errores UMI mejorada no solo reduce la incidencia de falsos positivos sino que también ofrece múltiples aplicaciones de diagnóstico, especialmente en escenarios que requieren un análisis longitudinal de muestras.

Al rectificar los errores de PCR en los UMI, se aumenta enormemente la precisión de la cuantificación molecular en diversas aplicaciones de secuenciación. Es una herramienta vital para los investigadores en secuenciación de ARN a granel, ARN unicelular y ADN, lo que permite análisis precisos de expresión genética y perfiles moleculares, tal como concluyeron los investigadores.